Procedimento Operacional Padrão - Eletroforese
É objetivo deste POP padronizar metodologia de eletroforese em gel de agarose para separação de moléculas, envolvendo a migração de partículas quando da aplicação de uma diferença potencial.
Este procedimento aplica-se a disciplina de estágio supervisionado de biotecnologia.
a) tampão de eletroforese (Tris-acetato-EDTA - TAE ou Tris-borato-EDTA - TBE);
b) tampão de corrida (Migração: azul de bromofenol - 300bp e xileno cianol - 4000bp);
3.2 Equipamentos e utensílios
c) bandejas de gel (diferentes tamanhos e de plástico transparente à UV);
d) pentes (para fazer poços);
h) erlenmeyers de 500 mL;
4.1 Preparo de gel de agarose (0,8%)
a) Para 100 mL de gel, pesar:
agarose........................8 g
b) adicionar 100mL de TAE 1X;
c) fundir a solução no microondas até homogeneizar (aproximadamente 1 min e 10 seg na potência máxima – evitar fervura);
d) enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba;
e) acrescentar 4µL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar com agitação leve;
obs.: brometo de etídio é mutagênico e deve ser manuseado com luvas.
f) despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas;
g) colocar o pente da espessura desejada no suporte;
obs.: verificar o número e o volume das amostras para escolher o pente mais adequado.
h) esperar a solução solidificar;
i) colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese;
j) adicionar tampão TAE 1X até cobrir a superfície do gel.
k) extrair 3µL da amostra de DNA;
l) homogeinizar com 1µL de tampão de corrida 5X (Loading Buffer);
m) aplicar as amostras nos poços;
n) reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida (Ladder-1Kb);
o) ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V);
p) analisar o gel sob radiação ultravioleta (Alpha Imager);
q) tirar foto dos resultados obtidos;
r) adicionar tampão de corrida ao material a ser purificado (diluição de 5X);
s) aplicar as amostras nos poços, pulando um poço entre cada amostra para evitar contaminação;
obs.: para volumes maiores, montar o gel com o pente de dentes largos ou unir os dentes do pente com fita adesiva antes de colocar o pente no gel ainda líquido (morno).
t) aplicar em outro poço o padrão de tamanho molecular (Ladder-1kb);
u) ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V);
v) vizualizar as bandas no gel utilizando a luz ultravioleta manual no comprimento de onda longo;
w) cortar a banda desejada utilizando bisturi limpo e colocá-la em um tubo de microcentrífuga previamente pesado;
x) seguir protocolo de Purificação de DNA a partir de Gel.
Solução TAE 1X (Tampão Tris-Acetate - Tris 40mM, Ac. Acetico 20mM,EDTA 1mM)
diluir a solução estoque 50x em água Milli-Q.
Ácido acético glacial 57,1mL
Azul de Bromofenol (0.125%) 0,0625g
Xileno Cianol (0.125%) 0,0625g
bb) Padrão de tamanho molecular
Ladder 1kb (Gibco BRL - 1µg/µL) 100µL
Tampão (Tris 10mM pH7,5, NaCl 50mM, EDTA 0,1mM) 500µL
cc) Brometo de etídeo (10mg/mL)
Água Milli-Q q.s.p. 100mL
Agitar durante 16 horas, guardar a 4°C.
obs.: concentração no gel: 5µg/mL
