#bacteria staining

[er-cryptid]

Patreon | Ko-fi    

[theyuanjourneys]

Bacterial Gram's Staining - [Differential Staining]

Bakteri adalah organisme prokariota yang masih memiliki identitas antar spesies (determinan), sehingga pasti ada karakteristik yang membedakan antar isolat. Karakter determinan dapat berupa uji katalis, proteolitik, lignolitik, hidrolitik, kebutuhan terhadap oksigen, motilitas, jumlah flagella, maupun karakter membran sel. Sel bakteri dapat berbentuk coccus, bacil, dan spiral, selain itu perbedaan membran terbagi menjadi gram negatif dan gram positif. Dr. Hans Christian Gram adalah penemu metode pewarnaan diferensial untuk membedakan bakteri dalam 2 grup major yang penting digunakan untuk klasifikasi.

Pewarnaan jenis diferensial menggunakan setidaknya 4 reagen yang terdiri atas primary stain, mordant, decolorizing agent, dan counterstain. Prosedur pewarnaan gram menggunakan kristal violet, Gram's iodine, alcohol 95%, dan safranin.

Metode pewarnaan Gram diawali dengan proses fiksasi bakteri pada kaca preparat yang bersih. Proses fiksasi bakteri dilakukan dengan menyiapkan aquadest steril pada kaca preparat sebanyak 50µl, mengambil isolat bakteri dengan jarum ose pada subkultur, kemudian jarum ose yang sudah ada spesimen diaduk pada tetesan air dikaca preparat yang sudah disiapkan, ratakan kemudian kering-anginkan. Apabila sudah cukup kering kemudian kaca preparat dipanaskan bagian bawahnya dengan api bunsen agar bakteri terfiksasi pada preparat. Pewarnaan dilakukan secara sistematis yaitu terdiri dari:

Perendaman spesimen bakteri terfiksasi dengan kristal violet (1 menit), kemudian bilas air mengalir.

Perendaman spesimen bakteri terfiksasi dengan Gram's Iodine mordant (1 menit), kemudian bilas air mengalir.

Teteskan perlahan alcohol 95% hanya sampai luntur, jangan terlalu lama (ikatan CV-1 dapat lepas). Lalu bilas air mengalir.

Berikan perendaman Safranin (45 detik) lalu bilas dengan air mengalir. Lakukan pengeringan dengan keringanginkan.

Berikan minyak imersi lalu amati ada perbesaran 1000×

Proses pewarnaan Gram dapat menghasilkan bakteri dengan warna ungu atau merah muda yang terjadi dalam tingkat molekul membran sel. Kristal violet sebagai primary stain mampu mewarnai seluruh sel bakteri, apabila ditambahkan mordant dalam bentuk iodine Gram maka afinitas sel akan meningkat terhadap pewarna dengan membentuk kompleks tak terlarut CV-I yang meningkatkan intensitas warna, dan seluruh sel akan terlihat ungu kehitaman. Pemberian alkohol 95% akan berperan sebagai pelarut lipid. Apabila terkena bakteri gram negatif maka alkohol meningkatkan porositas membran sel sehingga CV-I mudah lepas. Akan tetapi pada bakteri gram positif dengan peptidoglikan yang lebih tebal akan menyebabkan retensi ikatan CV-I sangat kuat, dan ketika terkena alkohol 95% maka akan terjadi dehidrasi yang menyebabkan membran sel makin rapat dan CV- I susah untuk hilang (Froböse et al., 2020; Cappuccino & Welsh, 2019; Tortora et al., 2019).

References:

Cappucino, J. G., & Welsh, C. (2019). Microbiology: a laboratory manual (12th ed). Pearson.

Froböse, N. J., Bjedov, S., Schuler, F., Kahl, B. C., Kampmeier, S., & Schaumburg, F. (2020). Gram staining: a comparison of two automated systems and manual staining. Journal of clinical microbiology, 58(12), 10-1128.

Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2019). Microbiology: an introduction (13th ed). Pearson