＊こちらは今年読んだ一番好きな論文2018の19日目の記事になります。
こんにちは、久留宮ソーダです。この「今年読んだ一番好きな論文」企画への参加は今回で2回目となります。昨年はDIYバイオに関する論文を紹介しましたが、今年はもっと自分の専門である医学よりの論文を取り扱いたいと思います。ということで今回紹介する論文はこちら！
Szablowski, J., O., Lue, B., et al. (2018). "Acoustically targeted chemogenetics for the non-invasive control of neural circuits".Nature Biomedical Engineering. 2:475-484.[1]
この時のNature Biomedical Engineeringの表紙も飾った論文です(↓)。Caltechの(あの)ShapiroLab.から出ているので、知っている人は知っているかもしれません。Shapiroは今年1月にAcoustic reporter genes for noninvasive imaging of microorganisms in mammalian hostsという論文をpublishし、natureの表紙を飾ったことでも有名です(こちらに関しては日本語で紹介もされています)。[2] ShapiroLab.では非侵襲的なimaging & controlを主に研究しているのですが、今回は後者のcontrolに関する論文を見ていきたいと思います。
医学研究におけるホットワードの一つに「遺伝子治療」があります。最近は11月に、中国で遺伝子編集された赤ちゃんが生まれたらしいということが大きな話題にもなりましたね。病気の中には、一部の細胞の遺伝子に変異が入ることで生じてしまうものがあります。そのような遺伝子を人為的に編集してしまうことで、病気の治療を試みようというアプローチが「遺伝子治療」です。この編集の方法はいろいろとあるのですが、代表的なものとしてアデノ随伴ウイルス(AAV)を利用した遺伝子導入が挙げられます。これは導入したいDNAをプラスミドとしてAAVに持たせ、AAVに目的の細胞にまでDNAを運んでもらうという方法です。AAVがどのような細胞膜上受容体を認識するのか調節すれば、どのcell typeに遺伝子導入するのか設定することまでできます。しかしながら、これでは遺伝子発現の空間的なcontrolがまだまだできません。例えば「脳の海馬or黒質だけに◯◯を発現させたい！」と思っても、AAVはあらゆる神経細胞に感染してしまうようにしか設計できないので、神経系全体で◯◯が発現してしまうのです。そこでShapiroらはこの空間的な発現制御を、彼らの十八番である超音波で実現できないかと考えました。このアイディアが非常に面白いです。
microbubblesでBlood-Brain Barrierに穴を開ける
現在、医療現場では血管の造影剤としてmicrobubblesが活用されています。これは気体をリン脂質等で包んだμmオーダーの単なる泡なのですが、中に空気が入っている為その表面で超音波が反射することができます(固有音響インピーダンスが異なるため)。またこのmicrobubblesはサイズごとに共鳴周波数が異なるこということも知られており、1点に集中するような超音波(Focused Ultrasound: FUS)を特定の周波数に固定してmicrobubblesに当てるとこれを巨大化させることも可能です(詳しくはコチラ)。[3] Shapiroらはこの技術を応用して、microbubblesをその内径が血管径を超えるまで巨大化させれば、血管の内皮細胞を内側から押し広げ内皮細胞間に隙間を作ることができるのではないかと考えました。特に脳の血管でこの現象を起こせばBlood-Brain Barrier(BBB)に穴が開き、その穴を通してAAVを空間特異的に神経細胞に感染させることができるかもしれないという訳です(下図)。えっ、めっちゃ雑！果たしてそんなことは起こるのでしょうか…？
今までの流れを整理するとこんな感じに。ちなみにこの画像は別の論文から引用したので、分かりづらいかもしれません...。[4] ただ意外といろんな人が似たようなことに注目してるんですね。
ShapiroらはプラスミドDNAをパッケージしたAAV9とmicrobubblesをマウスに静注し、その上で海馬に集中するように1.5MHzのFUSをかけてみました(別の論文によれば、1.5MHzのFUSをかけるとmicrobubblesの直径が4〜5μmとなり、これは脳内の毛細血管の内径とちょうど同じぐらいっぽい)。[3] そして数週間後に、切片を作成しmCherryが目的の部位で発現しているのかチェックしてみました。その結果が以下の図におけるcおよびdです。FUSを当てた部位は、aにて白い矢印で示されているところになります。ちなみにbはMRIで撮影したT1強調像で、FUSを当てた場所がほんのりと白くなっているということを示しています(つまりT1緩和時間が短いということです。これはFUSを当てたところではcavitationという泡の発生/消滅も同時に起きており、この現象によりmicrobubblesを構成する脂質類がばらけているからだと考えられます)。cやdからは、確かにaにて矢印で示されているところを中心にmCherryが発現していたことが読み取れます。またAAVを投与したけどFUSをかけなかったというcontrolがeです。このeと比べれば、遺伝子発現のspatial controlが成功していたというのは一目瞭然でしょう。
論文のFig. 2より。ちなみにc,d,eがちょっと青っぽいのは、核をDAPIで染めているからです。
これではまだn=1なので、次にマウス5匹で同様の実験を行ってみました。その結果をまとめたものが下図のaです。先ほどはざっくりと蛍光を見ただけでしたが、今回は細胞ごとに解析してみています。dはdorsal、vはventralの略称である他、CTXはcortexを意味しておりthalamusと同様にcontrolです(=FUSを当てていない)。縦軸はmCherryを発現していた細胞の割合だと思ってください。aのグラフからはdCA2やdCA3、vCA3では50%以上の細胞でmCherryが発現していたことが読み取れます。一方でCA1や歯状回(DG)ではあまり蛍光が見られませんでした。何ででしょうね(論文中では特にその要因について触れられていませんでした。血管からの距離とか？)。bはその切片の画像です。mCherry出てますね。
論文のFig. 3より一部抜粋。bで青いのはDAPIで染めた核です。
Shapiroたちは蛍光を見ただけでは満足しませんでした(私だったらhappyってなって実験終わりにしちゃいそう)。(遺伝子導入の効率はあまり高くないかもしれないけど)ここまで海馬特異的に遺伝子を発現させられるなら、海馬の主たる機能である記憶形成をcontrolできるのではないかと考えたのです。彼らが注目したのは恐怖体験です。まず今まで通り、マウスにAAVとmicrobubblesを投与し海馬にFUSを当てます。ここでBBBに穴が開き、うまくいけばAAVが海馬の神経細胞に感染するはずですね。AAVに入れたプラスミドはhM4Di-mCherryをコードしており、これがCaMKIIaプロモーターの下流で発現されるようになっていました。hM4DiはCNOというケミカルが結合すると、Giシグナルを活性化して神経細胞を脱分極させる受容体です。またCaMKIIaはexcitatory neuronにおいて発現しているタンパク質です。ゆえに今回デザインしたAAVは海馬の中でも特に興奮性神経細胞にhM4Diを発現させ、CNOが投与されるとこれらの細胞が脱分極するという仕組みになっているのです。なおこの際FUSを当てないマウスもcontrolとして用意しておきました。
こうして準備したマウスを6〜8週間育てた後、CNO or 生理食塩水(2018/12/20 トカイワインさんのご指摘で訂正)を投与してから恐怖体験させました(下図a参照)。この恐怖体験ではマウスをContext Aに置きながら電気ショックを与えます。そして24時間後再びマウスを同じContext Aに置いた時、前回の電気ショックの恐怖体験が記憶として形成されているのか確認するという訳です。もし記憶が形成されていれば、マウスはfreezingと呼ばれるじっと止まった状態に陥ります。その結果を示したのが下図bです。グラフにおいてCNOが−となっている場合では生食を投与しています。また縦軸はfreezeしていた時間の割合です。このグラフからCNOを投与してexcitatory neuronを抑制したマウスの方が、CNOを投与していないマウスよりfreezingの時間が短いということが分かります。さらにShapiroらはマウスに恐怖体験をrecallさせた後に、これらのマウスを別のContext Bに移してその行動を観察するという実験も行いました(Open Field Test)。その結果がcです。cからはCNO投与の有無に関わらず、マウスの活動性は変わらないということが読み取れます。また、そもそもFUSを当てていないcontrolのマウスを用いた実験結果がdおよびeに示してあります。これらのマウスでは、freezing時間の短縮やOpen Field Testにおける活動スコアの減少などは認められませんでした。つまり、FUSを用いた遺伝子導入は確かに恐怖記憶の形成を抑制したと言えるでしょう。
以上の流れをまとめてみましょう(下図)。まず導入したい遺伝子をプラスミドに乗せ、これをAAVにパッケージします。そしてこのAAVとmicrobubblesをヒトやマウスに投与し、遺伝子を発現させたい脳の領野にFUSを当てます。するとBBBに穴が開き周囲の神経細胞にAAVが感染します。その結果、空間特異的に目的の遺伝子を発現させられるという訳でした。また今回紹介したhM4DiとCNOのシステムのように、現在ではケミカルによって遺伝子の発現やタンパクの機能をON/OFFできます。これを利用すれば、導入した遺伝子が薬理学的作用を発揮するタイミングもコントロールできるのです。もしこのような遺伝子導入システムが医療として実現できれば、Parkinson Diseaseのような神経変性疾患がいとも簡単に治るようになるかもしれませんね。
論文のFig. 1より一部抜粋。ちなみにDREADDとはa Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugの略(長い！)。
もう少し詳しくメカニズムを知りたい！というような人は是非論文を読んでみてください(論文自体11ページもあったので、実際いくつかカットしている部分があります)。
ところで私がこの論文に出会ったのは今年の11月でした。Deisserothが講演をするために大学に来てくださったのですが、その際ゲストスピーカーとして一緒に招かれていたのがShapiroでした。実習が意外と長引いてしまいお目当てだったDeisserothの話は聞けなかったのですが、その代わりShapiroの熱烈な講演は全て聞くことができました。今回の論文もその講演の中で紹介されていたものです。面白いと感じる人やモノとの出会いは、実は全くもって予想していなかったところにあったりするのだなって思ったりもしました(でもDeisserothの講演は聞きたかった...)。
Szablowski, J., O., Lue, B., et al. (2018). "Acoustically targeted chemogenetics for the non-invasive control of neural circuits".Nature Biomedical Engineering. 2:475-484.
Bourdeau, R., W., Lee-Gosselin, A., et al. (2018). "Acoustic reporter genes for noninvasive imaging of microorganisms in mammalian hosts”. Nature. 553:86–90.
Tung, Y. S., Vlachos, F., et al. (2011). "The mechanism of interaction between focused ultrasound and microbubbles in blood-brain barrier opening in mice". The Journal of the Acoustical Society of America. 130(5):3059-67.
Hsu, P., H., Wei, K., C., et al. (2013). "Noninvasive and Targeted Gene Delivery into the Brain Using Microbubble-Facilitated Focused Ultrasound". PLOS ONE 8(2): e57682.
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